二)显色反应

1. 配制 DAB 孵育液：取适量的 DAB assay buffer 和 DAB 显色液，按 DAB assay buffer：

DAB 显色液=39:1 的比例混合，即为 DAB 孵育液，即配即用，不宜保存。

2. 配制 DAB 显色工作液：取适量的 DAB 孵育液和 DAB 增强剂，按 DAB 孵育液：DAB增强剂=2000～8000：1 的比例混合(具体比例应根据具体时间摸索确定)，即为 DAB显色工作液，即配即用，不宜保存。

3. 配制 1×DAB Wash buffer：取适量的 DAB Wash buffer(20×)，按 DAB Wash buffer：

蒸馏水=1:19 的比例混合，即为 1×DAB Wash buffer。室温保存，6 月有效。

4. 切片用蒸馏水清洗 3 次，每次 2min。

5. 切片入 10ml DAB 孵育液(提前 20℃温育)，避光孵育 20min，其间不断晃动。

6. 切片入 10ml DAB 显色工作液(提前 20℃温育)，避光孵育 20min，其间不断晃动。

7. 漂洗：取 10ml 左右的 1×DAB Wash buffer 漂洗切片 2-3 次，每次 5min。

8. 贴片，载玻片用铬明矾明胶包被，室温空气干燥。

9. 脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察棕色反应。

注意事项：

1. 如果出现高的反应背景或沉淀，表明 DAB 底物反应过于强烈。

2. 所用器皿必须洁净，避免含有氧化剂或还原剂，否则会产生非特异性反应。

3. DAB 显色液避免反复冻融，以免显色效率下降。

4. DAB 增强剂注意密闭保存，否则显色效率下降。